一种糖基化橙皮苷的合成及纯化方法
专利类型：发明专利
语 言：中文
申 请 号：CN201510175651.9
申 请 日：20150414
申 请 人：湖南鑫利生物科技有限公司重庆大学
申请人地址：426100 湖南祁阳经济开发区灯塔路
公 开 日：20150826
公 开 号：CN104862362A
代 理 人：
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摘 要：一种糖基化橙皮苷的合成及纯化方法，属于植物中黄酮化合物改性制备技术领域。本发明以市售橙皮苷为原料，经过制备橙皮苷溶液，制备橙皮苷超滤溶液，制备糖基化橙皮苷反应液，制备糖基化橙皮苷纯化浓缩液，制备糖基化橙皮苷冻干粉及制备多糖冻干粉的步骤制得产品。本发明生产设备简单，操作方便；工艺简单，能充分利用物料资源，生产成本低，提高了橙皮苷在水中的溶解度，产品纯度高达98％。采用本发明制备出的糖基化橙皮苷产品，其溶解性、功能性以及半衰期均较橙皮苷有了很大的改善，可广泛用于医药、食品、日用化学品等行业中。
主 权 项：一种糖基化橙皮苷的合成及纯化方法，其特征在于具体的方法步骤如下：(1)制备橙皮苷溶液以市售橙皮苷质量浓度为50～70％的粗橙皮苷为原料，按照粗橙皮苷的质量(kg)∶氢氧化钠溶液体积(L)比为1∶40～60的比例，在搅拌下向氢氧化钠溶液中加入粗橙皮苷，处理15～30分钟，即制备出橙皮苷溶液，用于制备橙皮苷超滤溶液，其中，所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度为0.1～1mol/L；(2)制备橙皮苷超滤溶液第(1)步完成后，先将第(1)步制备出的橙皮苷溶液泵入截留分子量为5000～10000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.05～0.2MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至橙皮苷溶液体积的1/10～1/20时停止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，即为橙皮苷超滤溶液，用于制备糖基化橙皮苷反应液，对收集的超滤截留液，主要含柑橘多糖，用于制备多糖冻干粉；(3)制备糖基化橙皮苷反应液第(2)步完成后，先按环糊精葡萄糖基转移酶∶橙皮苷∶β?环糊精的摩尔比为1∶150～500∶150～400的比例，依次将第(2)步制备出的橙皮苷超滤溶液，β?环糊精加入到搪玻璃反应釜中，向反应釜夹层通入循环热水，在搅拌下升温至50～70℃，再用稀盐酸溶液调节pH为6.0～8.0，接着加入环糊精葡萄糖基转移酶，恒温搅拌反应24～30h，反应完成后升温至80～90℃，保持5～15min，使酶失活，最后进行抽滤，弃滤渣并收集抽滤液，对收集的抽滤液，泵入截留分子量为150～500Da的纳滤器中，控制纳滤压力为0.1～0.5MPa，进行纳滤处理，直至纳滤截留液体积降低至抽滤液体积的1/5～1/10时停止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤滤过液，含少量氯化钠，送入生化处理池净化达标后排放，对收集的纳滤截留液，即为糖基化橙皮苷反应液，用于制备糖基化橙皮苷纯化浓缩液；(4)制备糖基化橙皮苷纯化浓缩液第(3)步完成后，将第(3)步收集的糖基化橙皮苷反应液用0.22～0.5μm的微孔滤膜过滤，弃滤渣并收集滤液，对收集的滤液泵入以反相C18硅胶为填料的制各型高效液相色谱中，进行色谱分离，控制色谱条件为：检测波长为283nm，柱温为25℃，流动相流速为20mL·min?1，糖基化橙皮苷反应液的进样量(L)：反相C18硅胶填料质量(Kg)比为1∶50～100，流动相中A组分为甲醇，B组分为醋酸水溶液，其中，醋酸∶水体积比为1∶14～17，梯度洗脱程序为：在0～15min区间，流动相中的A组分由35％上升至50％，B组分由65％下降至50％，在15～25min区间，流动相中的A组分由50％上升至75％，B组分由50％下降至25％，在25～30min区间，流动相中的A组分由75％上升至100％，B组分由25％下降至0％，分别收集过柱流出液和出峰时间为7.4～8.5min，9.6～12.4min及18.1～20.3min的洗脱流出液，对收集的过柱流出液，送入生化处理池进行净化处理，达标后排放，对收集的出峰时间为7.4～8.5min，9.6～12.4min及18.1～20.3min的洗脱流出液，在温度为50～70℃、绝对真空度为0.05～0.09MPa下进行真空浓缩，直至无甲醇味时止，分别收集出峰时间为7.4～8.5min浓缩液，出峰时间为9.6～12.4min浓缩液以及出峰时间为18.1～20.3min浓缩液和其真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩冷凝液，用去离子水调节其甲醇体积浓度为35％，可再次用于洗脱吸附于反相C18硅胶填料上的橙皮苷、单糖基化和二糖基化橙皮苷，对于收集的出峰时间为7.4～8.5min浓缩液，即为橙皮苷浓缩液，可再次用于制备橙皮苷溶液，对于收集的出峰时间为9.6～12.4min浓缩液及出峰时间为18.1～20.3min浓缩液，分别为单糖基化橙皮苷纯化浓缩液和二糖基化橙皮苷纯化浓缩液，分别用于制备单糖基化和二糖基化橙皮苷冻干粉；(5)制备糖基化橙皮苷冻干粉第(4)步完成后，将第(4)步收集的单糖基化橙皮苷纯化浓缩液和二糖基化橙皮苷纯化浓缩液分别置于?20～?40℃的低温冰箱中预冻4～10h，再分别送入冷冻干燥机中，在40～60Pa的绝对真空度、?50～?60℃温度下，进行冷冻干燥24～48小时，就分别制备出单糖基化橙皮苷冻干粉和二糖基化橙皮苷冻干粉，HPLC分析表明，单糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为98～99.5％，收得率为63.5～71.7％，二糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为98～99.5％，收得率为25.4～14.8％；(6)制备多糖冻干粉第(2)步完成后，先将第(2)步收集的超滤截留液用稀盐酸中和至pH?6.0～8.0，再向其中加入纯水，纯水加入量为中和后超滤截留液体积的5～8倍，即获得中和稀释液，将该中和稀释液搅拌均匀后泵入截留分子量为5000～10000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.05～0.2MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至中和稀释液体积的1/10～1/20时停止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，送入生化处理池进行生化处理，达标后排放，对收集的超滤截留液，将其置于?20～?40℃的低温冰箱中预冻2～4h，再分别送入冷冻干燥机中，在绝对真空度为40～60Pa、?40～?50℃的环境下冻干24～48h，就制备出多糖质量浓度达到85～91％的多糖冻干粉，其收得率为5.2～8.3％，平均分子量为18500Da。
关 键 词：
法律状态：公开
IPC专利分类号：C12P19/60(2006.01)I;C07H17/07(2006.01)I;C07H1/06(2006.01)I