动物衣原体多重套式PCR检测试剂盒及其检测方法

专利类型：发明专利

语言：中文

申请号：CN200910103457.4

申请日：20090326

发明人：李应国李正国王昱王国民肖进文聂福平袁陵吴东海刘生峰谭志周启民

申请人：重庆大学重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

申请人地址：400044重庆市沙坪坝区沙正街174号

公开日：20091223

公开号：CN101608239A

代理人：刘小红

代理机构：重庆市恒信知识产权代理有限公司

摘　　要：本发明涉及动物衣原体病的分型诊断试剂盒及其方法。本发明根据动物衣原体三种动物衣原体的ompA基因序列，设计了一对针对的上游及下游聚合酶链式反应寡聚核苷酸引物，可以扩增出所有动物衣原体的一条特异性片段，实现对动物衣原体属的所有衣原体进行有效的检测。在该引物的基础上，可以在临床核酸样本中单管同步扩增出三段长度大小不同的片段，在普通电泳中可以清晰分辨，从而实现对三种动物衣原体的同步检测。本发明利用套式多重PCR方法，单管同步检测猪衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体三种衣原体，从而降低了动物衣原体实验室动物衣原体疾病诊断的成本和工作量。特异性强、灵敏度高、可重复性高，且操作简便，没有繁杂的后处理。

主权项：1.一种猪衣原体多重套式PCR检测试剂盒，其特征是它包括Mix I PCR反应液管、Mix II PCR反应液管；阳性对照管、阴性对照管、样品裂解液A管、样品裂解液B管、提取液C管、异丙醇管、75％乙醇管、灭菌去离子水管；其中：(1)Mix I PCR反应管：管内由以下反应液组成：序列为SEQ ID NO1的25mM的上游引物0.3uL；序列为SEQ ID NO2的25mM的下游引物0.3uL；10×PCR buffer缓冲液2.5uL；10mM dNTP Mix 0.5uL；25mM MgCl2 1.5uL；5U/uL Taq聚合酶0.25uL；灭菌双蒸水16.65uL；合计22uL，为单次反应的用量；(2)Mi x II PCR反应液管：管内由以下反应液组成：序列为SEQ ID NO3的25mM的上游引物0.4uL；序列为SEQ ID NO4的25mM的下游引物0.2uL；序列为SEQ ID NO5的25mM的下游引物0.1uL；序列为SEQ ID NO6的25mM的下游引物0.2uL；10×PCR缓冲液2.5uL；10mM dNTP Mix 0.5uL；25mM MgCl2 2.0uL；5U/uL Taq聚合酶0.2uL；灭菌双蒸水15.9uL；合计22uL，为单次反应的用量；(3)阳性对照管：为猪源衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体各自的ompA基因重组质粒，比例为1∶1∶1，2uL～20uL，其如下：猪源衣原体ompA基因重组质粒pMD19-csuH的DNA序列为SEQ ID NO7；鹦鹉热衣原体ompA基因重组质粒pMD19-cpsH的DNA序列为SEQ ID NO8；肺炎衣原体ompA基因重组质粒pMD19-cpnH的DNA序列为SEQ ID NO9；(4)阴性对照管：阴性对照为无衣原体感染猪的肺脏组织DNA样品，2uL-20uL；(5)试剂管：样品裂解液A管：1.5mM EDTA，0.8mM Tris，150mM NaCl，0.5％SDS，共计30mL；样品裂解液B管：25mg/mL蛋白酶K，200～500uL；提取液C管：碱性酚/氯仿/异戊醇混合液＝25/24/1(pH8.0)，12～30mL；(6)灭菌去离子水管：1～2mL。

关键词：

法律状态：

IPC专利分类号：C12Q1/68(2006.01)I;C12R1/01(2006.01)N