同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法
专利类型：发明专利
语 言：中文
申 请 号：CN201510980547.7
申 请 日：20151223
申 请 人：重庆大学
申请人地址：400045 重庆市沙坪坝区沙正街174号
公 开 日：20160420
公 开 号：CN105505967A
代 理 人：郭云
代理机构：重庆市前沿专利事务所(普通合伙) 50211
摘 要：本发明公开了一种同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法,包括以下步骤：(1)构建M35S-8GWN载体、MNOS-8GWN载体和MOCS-8GWN载体；(2)克隆各目的基因,通过Not#I和Sbf#I将各基因分别组装到M35S-8GWN载体、MNOS-8GWN载体和MOCS-8GWN载体中,形成多个基因的表达盒；(3)将多个基因的表达盒通过同尾酶AsiS#I和Pac#I串联在一起；(4)将多基因表达盒通过Gateway#LR反应连接到目标表达载体上。还公开了三种用于构建多基因植物表达载体的入门载体M35S-8GWN、MNOS-8GWN、MOCS-8GWN。
主 权 项：一种同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法,其特征在于,包括以下步骤：(1)构建M35S#8GWN载体、MNOS#8GWN载体和MOCS#8GWN载体,所述三种载体的结构分别如图2～4所示,构建方法为用EcoR#I分别酶切含有M35S序列、MNOS序列和MOCS序列的pUC57载体,分别与用EcoR#I酶切并去磷酸化的pCR8/GW/TOPO载体连接,获得M35S#8GWN载体、MNOS#8GWN载体和MOCS#8GWN载体；所述M35S序列从5’端到3’端依次含有EcoR#I酶切位点、AsiS#I酶切位点、35S启动子、Not#I酶切位点、Sbf#I酶切位点、HA标签序列、35S终止子、Pac#I酶切位点、Asc#I酶切位点、EcoR#I酶切位点,所述M35S序列的核苷酸序列如序列表SEQ#ID#NO.1所示；所述MNOS序列从5’端到3’端依次含有EcoR#I酶切位点、AsiS#I酶切位点、NOS启动子、Not#I酶切位点、Sbf#I酶切位点、Flag标签序列、NOS终止子、Pac#I酶切位点、Asc#I酶切位点、EcoR#I酶切位点,所述MNOS序列的核苷酸序列如序列表SEQ#ID#NO.2所示；所述MOCS序列从5’端到3’端依次含有EcoR#I酶切位点、AsiS#I酶切位点、OCS增强子、OCS启动子、Not#I酶切位点、Sbf#I酶切位点、Myc标签序列、OCS终止子、Pac#I酶切位点、Asc#I酶切位点、EcoR#I酶切位点,所述MOCS序列的核苷酸序列如序列表SEQ#ID#NO.3所示；(2)克隆各目的基因,然后通过Not#I和Sbf#I将各目的基因分别组装到M35S#8GWN载体、MNOS#8GWN载体和MOCS#8GWN载体中,形成多个具有不同启动子、标签和终止子的独立表达盒；(3)将步骤(2)得到的多个独立表达盒通过同尾酶AsiS#I和Pac#I串联在一起,得到串联的多个基因表达盒；(4)将步骤(3)得到的串联表达盒通过Gateway#LR反应连接到目标表达载体上,即得到具有多个基因表达盒的表达载体。
关 键 词：
法律状态：
IPC专利分类号：C12N15/66;C12N15/63;C12N15/82