一种从萝卜籽中提取硫代葡萄糖苷酶的方法
专利类型：发明专利
语 言：中文
申 请 号：CN201710346968.3
申 请 日：20170517
申 请 人：重庆大学
申请人地址：401331重庆市沙坪坝区大学城南路55号重庆大学虎溪校区
公 开 日：20170721
公 开 号：CN106967699A
代 理 人：
代理机构：
摘 要：一种从萝卜籽中提取硫代葡萄糖苷酶的方法，属于分离纯化技术领域。本发明以新鲜萝卜籽为原料，制备出比活力为40.35～45.65U/mg、收得率为0.4～0.6‰的硫代葡萄糖苷酶，产品质量符合市场要求。本发明采用萝卜籽自然萌芽的方式对其进行脱脂处理，条件温和，有利于保持酶的稳定；提取过程中加入甘油作为保护剂，在制备冻干粉时又加入蔗糖溶液作为保护剂，最大限度地稳定了酶分子的构象；以壳寡糖修饰棉纤维这一具有抗菌性的新型材料为载体，利用静电作用对硫代葡萄糖苷酶进行有效吸附和分离；采用超滤膜技术对提取液进行浓缩，使用溶剂低温回收真空系统回收乙醇，显著降低了生产成本。制备出的硫代葡萄糖苷酶冻干粉可广泛应用于固定化酶及制备莱菔素等领域中。??全部
主 权 项：一种从萝卜籽中提取硫代葡萄糖苷酶的方法，其特征在于具体的工艺步骤如下：(1)制备天然脱脂萝卜籽粉取新鲜萝卜籽，先用质量分数为8～12％的次氯酸钠溶液浸泡10～15min，再用无菌水漂洗3～5次，每次1～5min，然后置于铺有2层滤纸的培养皿上，放入温度为20～30℃的培养箱中恒温培养，直至萝卜籽发芽，收集发芽的萝卜籽并将芽剪除，余下的种子部分再置于30～40℃的烘箱内干燥，待其干燥后用中药粉碎机粉碎，再用80～160目的分样筛进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者，对于未过筛的萝卜籽粉，返回粉碎机进行再次粉碎；对于过筛的萝卜籽粉，即为天然脱脂萝卜籽粉，用于第(3)步制备硫代葡萄糖苷酶提取液；(2)制备Tris?HCl?甘油缓冲保护溶液先按照Tris的质量与纯净水的体积之比为0.24∶1(kg/L)的比例，将称量好的Tris在搅拌下用纯净水溶解，配制成Tris浓度为为0.2mol/L的溶液，即制备出Tris溶液，再按照Tris的质量与浓盐酸的体积之比为1∶0.50～0.58(kg/L)的比例，将浓盐酸与制备出的Tris溶液混合均匀，即制备出pH为7.4～7.6的Tris?HCl缓冲溶液，再按照体积百分含量为4～6％的比例，向Tris?HCl缓冲溶液中加入甘油作为提取过程中酶的保护剂，即制备出Tris?HCl?甘油缓冲保护溶液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶提取液；(3)制备硫代葡萄糖苷酶提取液第(2)步完成后，按照天然脱脂萝卜籽粉的质量与Tris?HCl?甘油缓冲保护溶液的体积之比为1∶5～6(kg/L)的比例，将天然脱脂萝卜籽粉加入到Tris?HCl?甘油缓冲保护溶液中，用匀浆机在8000～12000r/min的速度下高速粉碎，对收集的粉碎分散液，置于常温下搅拌30～40min，之后用7～9层纱布过滤并收集滤液，对收集的滤液，用蠕动泵泵入管式离心机中，在10000～20000r/min的转速下离心15～25min并收集上清液，对收集的上清液，于4℃冰箱中放置2～3h，然后在搅拌下向其中缓慢加入2～3倍体积的95％乙醇，加完后再置于4℃冰箱中放置2～3h，然后再次泵入管式离心机中，在10000～20000r/min的转速下离心15～25min，分别收集沉淀和上清液，对收集的上清液，用于第(9)步制备回收乙醇；对收集的沉淀，即为硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀，按照其质量与Tris?HCl?甘油缓冲保护溶液的体积之比为1∶5～6(kg/L)的比例，将沉淀溶于Tris?HCl?甘油缓冲保护溶液中，即制备出硫代葡萄糖苷酶提取液，用于第(5)步制备富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床；(4)装配固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床按照专利号为201510028848.X介绍的方法制备出壳寡糖修饰棉纤维，将该壳寡糖修饰棉纤维分散于2～3倍体积的纯净水中润湿，再装填于内径为100～300mm、高度为400～800mm的自制不锈钢固定化吸附反应床中，其中壳寡糖修饰棉纤维的装填高度为300～600mm，即装配出固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床；(5)制备富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床第(3)步和第(4)步完成后，先向第(4)步装配出的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床中泵入Tris?HCl?甘油缓冲保护溶液，该缓冲保护溶液泵入流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的1～3倍/h(BV/h)，泵入时间为1～2h，缓冲保护溶液泵入完成后，按照装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积与第(3)步制备的硫代葡萄糖苷酶提取液体积之比为1∶4～6(L/L)的比例，将硫代葡萄糖苷酶提取液泵入固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床中，泵入硫代葡萄糖苷酶提取液的流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的1～2倍/h(BV/h)，泵入完成后，分别收集脱去硫代葡萄糖苷酶的经床流出液和吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，对收集的脱去硫代葡萄糖苷酶的经床流出液，用于下批次溶解硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀而制备硫代葡萄糖苷酶提取液；对收集的吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，即为富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶分离液；(6)制备硫代葡萄糖苷酶分离液首先制备出pH为8.0～9.0的稀Na2CO3溶液，再按照体积百分含量为4～6％的比例，向稀Na2CO3溶液中加入甘油，即制备出Na2CO3?甘油溶液，第(5)步完成后，对第(5)步收集的富集硫代葡萄糖苷酶的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，泵入Na2CO3?甘油溶液进行洗涤，泵入的Na2CO3?甘油溶液的体积为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的2～4倍，泵入Na2CO3?甘油溶液的流速为装配的壳寡糖修饰棉纤维床层体积的2～4倍/小时，洗涤完成后，分别收集洗涤后的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床和经床洗涤液，对收集的洗涤后的固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，即为再生固定化壳寡糖修饰棉纤维吸附反应床，可用于制备下批次吸附硫代葡萄糖苷酶；对收集的经床洗涤液，即为硫代葡萄糖苷酶分离液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶浓缩液；(7)制备硫代葡萄糖苷酶浓缩液第(6)步完成后，将第(6)步制备的硫代葡萄糖苷酶提取液泵入截留分子量为50000～100000Da的超滤器中，在表压为0.2～0.5MPa下进行第一次超滤，直至第一次超滤截留液与第一次超滤滤过液体积之比(L/L)为1∶7～9时止，分别收集第一次超滤滤过液和第一次超滤截留液，对收集的第一次超滤截留液，主要含大分子的多糖，可用于制备萝卜籽多糖；对收集的第一次超滤滤过液，用纯净水稀释至原体积，再次泵入截留分子量为10000～20000Da的超滤器中进行第二次超滤，第二次超滤的表压及停止第二次超滤时第二次超滤截留液与第二次超滤滤过液体积之比均与第一次超滤相同，第二次超滤完成后，分别收集第二次超滤滤过液和第二次超滤截留液，对收集的第二次超滤滤过液，可用于稀释下批次的第一次超滤滤过液；对收集的第二次超滤截留液，即为出硫代葡萄糖苷酶浓缩液，用于下步制备硫代葡萄糖苷酶冻干粉；(8)制备硫代葡萄糖苷酶冻干粉第(7)步完成后，按照蔗糖溶液的体积与硫代葡萄糖苷酶浓缩液体积之比为1∶20～25(L/L)的比例，向第(7)步制备的硫代葡萄糖苷酶浓缩液中加入浓度为80～120mmoL/L的蔗糖溶液作为冷冻干燥保护剂，然后置于?40～?20℃冰箱中预冻8～12h，再取出放置于真空冷冻干燥机中，在真空度为30～50Pa、温度为?50～?40℃的条件下冷冻干燥24～36h，即制备出硫代葡萄糖苷酶冻干粉，其比活力为40.35～45.65U/mg、收得率为0.4～0.6‰；(9)制备回收乙醇第(3)步完成后，将第(3)步第二次离心收集的上清液泵入低温高真空溶剂回收装置，在温度为30～45℃、真空度为0.1～3kPa的条件下回收乙醇，直至无乙醇味时止，即制备出回收乙醇，可用于再次配制乙醇体积百分浓度为95％的水溶液。
关 键 词：
法律状态：生效
IPC专利分类号：C12N9/24(2006.01)I