松材线虫分子检测快速制样方法
专利类型：发明专利
语 言：中文
申 请 号：CN200710092787.9
申 请 日：20070929
申 请 人：重庆大学
申请人地址：400030 重庆市沙坪坝区沙正街174号
公 开 日：20100526
公 开 号：CN101153334B
代 理 人：郭云
代理机构：重庆市前沿专利事务所 50211
摘 要：本发明涉及一种松材线虫分子检测快速制样方法，是专门针对对林业影响巨大的松材线虫而建立起的快速制样的方法。利用该方法，不需要分离线虫，就可以直接提取疫木中松材线虫DNA用于分子检测。配合PCR技术，可以检测出1.5克木屑中的1条松材线虫，时间仅需要3h，效果稳定可靠。该方法克服了传统松材线虫检测制样方法时间较长、效果不稳定的缺点；适用于进出口通关木质材料松材线虫的快速检验检疫和林间病害早期诊断中大批量样品的检测。
主 权 项：一种松材线虫分子检测快速制样方法，其特征在于，按以下步骤进行：[1]用直径为7～10mm的电钻在待测木质材料上钻取木屑，将所得木屑混合均匀，取1～8克的木屑放于5～20ml离心管中；[2]将裂解液按每克木屑2～3毫升溶液的比例加入步骤[1]的离心管中，62～68℃水浴1～2小时；所述裂解液由0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)，0.4M乙二胺四乙酸(EDTA)，1％十二烷基磺酸钠(SDS)在常温下的混合物，pH值为8.0；[3]将步骤[2]所得混合液经5000rcf离心10min后，将其上清液600μl～1ml转入另一2～3ml离心管中，加入一定量的变性液，使变性液的终浓度为4M，混合均匀后，室温下放置8～15min，10000rcf离心8～10min后将上清液转入DNA吸附柱中，10000rcf离心1～2min，弃滤液；所述变性液是12M异硫氰酸胍；[4]在上一步的DNA吸附柱中加入清洗液600～800μl，10000rcf离心1～2min清洗DNA，弃滤液；所述I清洗液是70％乙醇(V/V)；[5]重复步骤[4]一次；[6]再次离心除去所述的清洗液；[7]DNA吸附柱中加入溶解液50～60μl溶解DNA，10000rcf离心1～2min，收集滤液，即为松材线虫DNA样品，直接用于PCR检测；所述溶解液为超纯水。
关 键 词：
法律状态：授权
IPC专利分类号：C12Q1/68(2006.01)I